ย้อมแกรมแบคทีเรีย ต้องหยดอะไร

กว่าจะรู้สี… สารละลายสำคัญในการย้อมแกรมแบคทีเรีย

การย้อมแกรม เป็นเทคนิคพื้นฐานและสำคัญอย่างยิ่งในจุลชีววิทยา ใช้ในการจำแนกแบคทีเรียออกเป็นสองกลุ่มหลัก คือ แกรมบวก (Gram-positive) ซึ่งจะปรากฏสีม่วง และแกรมลบ (Gram-negative) ซึ่งจะปรากฏสีแดง ความแตกต่างของสีนี้สะท้อนถึงความแตกต่างในโครงสร้างผนังเซลล์ของแบคทีเรียทั้งสองกลุ่ม แต่กระบวนการย้อมสีที่ดูเรียบง่ายนี้ กลับซ่อนความละเอียดอ่อนและความสำคัญของสารละลายต่างๆ ไว้ เราจึงมาทำความรู้จักกับสารละลายสำคัญแต่ละตัวในการย้อมแกรมกัน

กระบวนการย้อมแกรม ประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญสี่ขั้นตอน โดยแต่ละขั้นตอนล้วนต้องอาศัยสารละลายเฉพาะอย่าง ดังนี้:

1. ขั้นตอนการย้อมสีหลัก (Primary Stain): คริสตัลไวโอเลต (Crystal Violet)

สารละลายแรกที่ใช้คือ คริสตัลไวโอเลต เป็นสารสีม่วงอัญชัญ ซึ่งจะเข้าไปจับกับเปปไทโดไกลแคน (Peptidoglycan) ในผนังเซลล์ของแบคทีเรียทั้งแกรมบวกและแกรมลบ ทำให้เซลล์แบคทีเรียทั้งสองชนิดมีสีม่วงในขั้นตอนนี้

2. ขั้นตอนการใช้สารช่วยยึดสี (Mordant): ไอโอดีน (Gram’s Iodine)

หลังจากนั้น จะใช้สารละลายไอโอดีน ไอโอดีนจะทำหน้าที่เป็นสารช่วยยึดสี โดยสร้างคอมเพล็กซ์กับคริสตัลไวโอเลต ทำให้คริสตัลไวโอเลตยึดติดกับผนังเซลล์ได้แน่นขึ้น ขั้นตอนนี้สำคัญมาก โดยเฉพาะในแบคทีเรียแกรมบวก ที่มีชั้นเปปไทโดไกลแคนหนา ทำให้ยึดคริสตัลไวโอเลตได้แน่นกว่า

3. ขั้นตอนการล้างสี (Decolorization): แอลกอฮอล์ (Alcohol or Acetone-Alcohol)

ขั้นตอนนี้เป็นขั้นตอนที่สำคัญที่สุดในการแยกแยะแกรมบวกและแกรมลบ โดยใช้แอลกอฮอล์หรือสารละลายอะซีโตน-แอลกอฮอล์ ในแบคทีเรียแกรมลบที่มีชั้นเปปไทโดไกลแคนบาง และมีเยื่อหุ้มชั้นนอก (Outer membrane) แอลกอฮอล์จะละลายเยื่อหุ้มชั้นนอก ทำให้คริสตัลไวโอเลต-ไอโอดีนคอมเพล็กซ์ถูกชะล้างออกไป ทำให้เซลล์กลายเป็นสีใส ในขณะที่แบคทีเรียแกรมบวกที่มีชั้นเปปไทโดไกลแคนหนา จะไม่ถูกชะล้าง ยังคงสีม่วงไว้

4. ขั้นตอนการย้อมสีทับ (Counterstain): แซฟฟรานิน (Safranin)

สุดท้าย ใช้สารละลายแซฟฟรานิน ซึ่งเป็นสารสีแดง ย้อมทับเซลล์ที่ถูกชะล้างสีในขั้นตอนก่อนหน้า ทำให้เซลล์แบคทีเรียแกรมลบ ซึ่งเป็นสีใส กลายเป็นสีแดง ในขณะที่แบคทีเรียแกรมบวก ซึ่งยังคงสีม่วงจากคริสตัลไวโอเลต จะไม่เปลี่ยนสี

สรุปแล้ว การย้อมแกรมต้องการสารละลายสำคัญ 4 ชนิด ได้แก่ คริสตัลไวโอเลต, ไอโอดีน, แอลกอฮอล์ (หรืออะซีโตน-แอลกอฮอล์) และแซฟฟรานิน การเลือกใช้และปริมาณที่เหมาะสมของสารละลายเหล่านี้ เป็นกุญแจสำคัญสู่ความสำเร็จในการจำแนกแบคทีเรียอย่างถูกต้อง และนำไปสู่การวินิจฉัยโรคและการรักษาที่เหมาะสมต่อไป